بیان هترولوگ، خالص سازی و بررسی قابلیت اتصال به فلز یکی از ایزوفروم های تیپ 3 متالوتیونین برنج (oryza sativa)

در سال های اخیر، افزایش ورود آلایند های زیستی به اکوسیستم های طبیعی تبدیل به یکی از مهمترین چالش های زندگی روزمره انسان شده است. در این میان آلودگی با فلزات سنگین که عمدتاً در اثر فعالیت های صنعتی ایجاد می گردد، بدلیل ویژگی تجزیه ناپذیری زیستی و شیمیایی از خطرناکترین آلوده کننده ها بشمار می آید. در سلول های موجودات زنده بمنظور کاهش اثرات سمیت فلزات مکانیسم هایی تعبیه شده است که از جمله آن می توان پروتئین هایی با خاصیت تمایل زیاد به کلاته کردن فلز را نام برد. متالوتیونین ها (mts) گروهی از پروتیین های با وزن ملکولی پایین و سرشار از اسید آمینه سیستیین هستند که بواسطه دارا بودن گروه تیول توانایی پیوند با فلزات مختلف را دارند. متالوتیونین های گیاهی، مطابق طبقه بندی انجام شده بر پایه الگوی پراکنش اسید آمینه سیستئین، در چهار تیپ تقسیم بندی شده اند. تاکنون پژوهش ها در رابطه با متالوتیونین بیشتر بر روی آنالیز بیان آنها در بافت های مختلف با استفاده از روش rt-pcr متمرکز شده و کمتر به نقش اختصاصی ایزوفرم های مختلف در سطح پروتئین پرداخته اند. این تحقیق بمنظور بررسی نقش پروتئین osmti-3a که یکی از ایزوفرم های تیپ3 برنج می باشد در ایجاد تحمل به تنش فلزات سنگین و قابلیت اتصال به فلز این ایزوفرم انجام گردید. بدین منظور با طراحی آغازگر های اختصاصی، توالی ژن کد کننده این پروتئین در جایگاه برشی ecor1و hindiii در پایین دست پروموترt7 همسانه سازی و سپس به سویه بیانی rosetta(de3) منتقل گردید. با القای بیان توسط iptg تولید مقیاس وسیع سویه شاهد rosetta-pet41a وسویه نوترکیب rosetta-pet-41a-osmti-3a میسر گشت. با رسم منحنی های رشد درحضور نمک های کلرید کادمیوم، سولفات منیزیم، سولفات روی و کلرید نیکل، تحمل باکتری سویه نوترکیب به فلزات بررسی گردید. همچنین با اندازه گیری مقدار فلزات در محیط کشت توسط دستگاه طیف سنجی جذب اتمی(aas)، به بررسی میزان حذف فلزات توسط باکتری تولید کننده پروتئین osmti-3a پرداخته شد. با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی، خالص سازی پروتئین های کنترل gst و نوترکیب gst-osmti-3aانجام و با مقایسه آنها در محیط in vivo و شرایط in vitro توسط واکنش با ماده dtnb و همچنین تغییرات در جذب نوری، تمایل و ظرفیت اتصال به فلزات پروتئین نوترکیب osmti-3a-gst سنجیده شد. نتایج حاصل از بررسی تحمل سویه نوترکیب به فلزات نشان داد پروتئین نوترکیب osmti-3a-gst موجب افزایش تحمل سلول های باکتری rosetta-pet-41a-osmti-3a به فلزات نیکل، کادمیوم و روی شد در حالی که تولید این پروتئین موجب افزایش تحمل سلول های باکتری rosetta-pet-41a-osmti-3a به فلز مس نگردید. از واکنش dtnb با پروتئین های نوترکیب تولید شده در محیط in vivoو شرایط in vitro مشخص شد تمایل پروتئین osmti-3a-gst به فلزات بررسی شده بترتیب بصورت cd>ni>zn>cu می باشد. اندازه گیری و مقایسه میزان فلز در فاز محیط کشت سویه های شاهد و نوترکیب با دستگاه aas نشان داد پروتئین نوترکیب osmti-3a-gst موجب کاهش فلزات کادمیوم، نیکل و روی بترتیب به میزان 17/2،12/6 و 8/4 درصد از محیط کشت گردید درحالی که در مورد فلز مس بیان این ژن کاهش قابل ملاحظه ای را در حذف فلز از محیط کشت نشان نداد. در نهایت با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد پروتئین osmti-3a قابلیت اتصال به فلزات کادمیوم،نیکل و روی را دارد.